जीन थेरेपी उत्पादों के वायरल क्लीयरेंस सत्यापन अध्ययन प्रोटोकॉल के लिए मुख्य डिजाइन विचार

ICH Q5A(R2)-इंटरनेशनल हार्मोनाइजेशन फाउंडेशन

ICH Q5A(R2) को आधिकारिक तौर पर 1 नवंबर, 2023 को अपनाया गया था, और यह वायरल सुरक्षा मूल्यांकन के लिए मुख्य अंतरराष्ट्रीय मार्गदर्शन दस्तावेज़ का प्रतिनिधित्व करता है। 1999 में प्रकाशित Q5A(R1) की तुलना में, R2 संस्करण में महत्वपूर्ण अपडेट में शामिल हैं: निरंतर विनिर्माण में वायरल सुरक्षा मूल्यांकन पर एक नया जोड़ा गया अध्याय (अध्याय 7); वायरल क्लीयरेंस रणनीतियों की नींव के रूप में जोखिम मूल्यांकन की एक प्रबलित भूमिका; वायरल पहचान संबंधी विचारों में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) का समावेश; और नए उत्पादों और विनिर्माण प्रक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए स्पष्ट आवश्यकताएं। Q5A(R2) को FDA, EMA और PMDA सहित नियामक प्राधिकरणों द्वारा अपनाया गया है, जो दुनिया भर में वायरल क्लीयरेंस सत्यापन के लिए एक एकीकृत तकनीकी ढांचा प्रदान करता है।

एनएमपीए-चीनी नियामक प्रणाली

वायरल सुरक्षा के लिए एनएमपीए नियामक ढांचा कई स्तरों को कवर करता है:

दस्तावेज़ स्तर	दस्तावेज़ का नाम	जारी करने का वर्ष
मूलभूत दस्तावेज़	रक्त उत्पादों से वायरस को हटाने/निष्क्रिय करने के लिए तकनीकी दिशानिर्देश	2002
मूलभूत दस्तावेज़	जैविक ऊतकों के वायरल सुरक्षा मूल्यांकन की तकनीकी समीक्षा के लिए सामान्य सिद्धांत	2005
उत्पाद-विशिष्ट दिशानिर्देश	फार्मास्युटिकल अनुसंधान के लिए तकनीकी दिशानिर्देश और रीकॉम्बिनेंट एडेनो के लिए क्लिनिकल परीक्षण अनुप्रयोगों का मूल्यांकन -एसोसिएटेड वायरस (आरएएवी) वेक्टर {{1}वीवो जीन थेरेपी उत्पादों पर आधारित	2023
उत्पाद-विशिष्ट दिशानिर्देश	विपणन प्राधिकरण अनुप्रयोगों के लिए विवो जीन थेरेपी उत्पादों पर आधारित रीकॉम्बिनेंट एडेनो की फार्मास्युटिकल गुणवत्ता के लिए सामान्य तकनीकी आवश्यकताएं	2025
अभिनव दिशानिर्देश	चिकित्सीय पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादों (परीक्षण) के नैदानिक ​​​​परीक्षण अनुप्रयोगों के लिए वायरल क्लीयरेंस प्रक्रियाओं के प्लेटफ़ॉर्म सत्यापन के लिए तकनीकी दिशानिर्देशa	2024

a: यह दिशानिर्देश पहली बार दर्शाता है कि चीनी नियामक प्राधिकरण ने वायरल क्लीयरेंस प्रक्रियाओं के प्लेटफ़ॉर्म सत्यापन के लिए व्यवस्थित तकनीकी आवश्यकताओं को निर्धारित किया है, और ICH Q5A(R2) की भावना के अनुरूप है।

एफडीए और ईएमए-यूएस और यूरोपीय नियामक आवश्यकताएँ

FDA ने औपचारिक रूप से जनवरी 2024 में ICH Q5A(R2) पर आधारित एक उद्योग मार्गदर्शन दस्तावेज़ जारी किया। इसके अलावा, यूनाइटेड स्टेट्स फार्माकोपिया (USP) अध्याय<1050.1>वायरल क्लीयरेंस प्रक्रियाओं के डिजाइन, मूल्यांकन और लक्षण वर्णन पर पूरक तकनीकी मार्गदर्शन प्रदान करता है। एफडीए हर दो साल में एक वायरल क्लीयरेंस संगोष्ठी आयोजित करता है; 2023 संगोष्ठी में नए तौर-तरीकों, निरंतर विनिर्माण, नए क्रोमैटोग्राफी मीडिया और सोखने वाले फिल्टर जैसे अत्याधुनिक विषयों को संबोधित किया गया। ईएमए के मुख्य मार्गदर्शन दस्तावेजों में सीपीएमपी/बीडब्ल्यूपी/268/95 (वायरस सत्यापन अध्ययन पर मार्गदर्शन के लिए नोट: वायरस के निष्क्रियता और निष्कासन को मान्य करने वाले अध्ययनों का डिजाइन, योगदान और व्याख्या) और ईएमईए/सीएचएमपी/बीडब्ल्यूपी/398498/2005 (जैव प्रौद्योगिकी जांच औषधीय उत्पादों के वायरस सुरक्षा मूल्यांकन पर दिशानिर्देश) शामिल हैं, जिनमें से दोनों में सामंजस्य स्थापित किया गया है। ICH Q5A(R2) के साथ।

वायरल संदूषण स्रोतों की पहचान

ICH Q5A(R2) इस बात पर जोर देता है कि वायरल क्लीयरेंस सत्यापन का डिज़ाइन व्यापक जोखिम मूल्यांकन पर आधारित होना चाहिए। जीन थेरेपी उत्पादों के लिए, वायरल संदूषण स्रोतों की पहचान निम्नलिखित स्तरों पर होनी चाहिए:

सेल बैंक स्तर: अंतर्जात वायरस (उदाहरण के लिए, रेट्रोवायरल कण) और गुप्त रूप से संक्रामक वायरस संभावित रूप से उत्पादन सेल सब्सट्रेट्स (उदाहरण के लिए, HEK293, CHO, हेला) में मौजूद होते हैं। HEK293 कोशिकाओं को अंतर्जात Ad5 E1 अनुक्रम और लगभग 900 bp EBV टुकड़े के लिए जाना जाता है, और प्रतिकृति {{10}सक्षम एडेनोवायरस व्यक्त करने में सक्षम हैं; इसलिए, जोखिम मूल्यांकन में इस जोखिम पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए।

हेल्पर वायरस स्तर: एएवी वेक्टर उत्पादन आम तौर पर हेल्पर प्लास्मिड का उपयोग करके ट्रिपल ट्रांसफ़ेक्शन जैसे तरीकों को नियोजित करता है, जो प्रतिकृति उत्पन्न करने का जोखिम उठाता है -सक्षम एडेनोवायरस (आरसीए)। इसी प्रकार, लेंटीवायरल वेक्टर उत्पादन में उपयोग की जाने वाली पैकेजिंग कोशिकाएं सक्षम लेंटीवायरस (आरसीएल) प्रतिकृति उत्पन्न कर सकती हैं।

कच्चे माल का स्तर: सेल कल्चर मीडिया, फ़ीड और एंजाइम सहित विनिर्माण में उपयोग किए जाने वाले कच्चे माल के माध्यम से साहसिक वायरस पेश किए जा सकते हैं। यह जोखिम विशेष रूप से तब महत्वपूर्ण होता है जब जानवरों से प्राप्त घटकों (उदाहरण के लिए, भ्रूण गोजातीय सीरम, ट्रिप्सिन डाइजेस्ट समाधान) का उपयोग किया जाता है।

जोखिम अंतर: जीन थेरेपी बनाम पारंपरिक पुनः संयोजक प्रोटीन

जोखिम का आयाम	पारंपरिक पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पाद	जीन थेरेपी उत्पाद
वायरल स्रोत	सेल बैंक से अंतर्जात वायरस; साहसिक वायरस	सेल बैंक वायरस; सहायक वायरस; प्रतिकृति-सक्षम वैक्टर (आरसीवी/आरसीएल); मेजबान जीनोम एकीकरण
सेल सब्सट्रेट	CHO, NS0, Sp2/0 और अन्य अच्छी तरह से विशेषता वाली कोशिका रेखाएँ	HEK293, हेला, CHO, आदि; कुछ कोशिका रेखाएं ट्यूमरजेनिक मूल की होती हैं
उत्पाद विशेषताएँ	प्रोटीन-आधारित दवा; अच्छी तरह से परिभाषित संरचना	वायरल वेक्टर; जैव सुरक्षा जोखिम उत्पन्न करता है
सत्यापन रणनीति	बहु-चरणीय वायरल क्लीयरेंस; प्रक्रिया चरण सत्यापन पर जोर	आरसीवी/आरसीएल का पता लगाना आवश्यक; सत्यापन और परीक्षण दोनों आवश्यक
प्लेटफ़ॉर्म सत्यापन	एस/डी, कम पीएच, नैनोफिल्ट्रेशन जैसी स्थापित प्रक्रियाओं पर लागू	वेक्टर प्रकारों की विविधता के कारण सीमित प्रयोज्यता

तालिका 1. वायरल सुरक्षा जोखिमों की तुलना: जीन थेरेपी उत्पाद बनाम पारंपरिक पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पाद

सामान्य सिद्धांतों

वायरल क्लीयरेंस सत्यापन प्रोटोकॉल के डिजाइन में संकेतक वायरस चयन एक केंद्रीय तत्व है। ICH Q5A(R2) के लिए आवश्यक है कि संकेतक वायरस का चयन जोखिम मूल्यांकन पर आधारित हो और निम्नलिखित कारकों को ध्यान में रखा जाए:

उत्पादन सेल सब्सट्रेट के लिए वायरस की प्रासंगिकता (प्रासंगिक वायरस)

वायरस के भौतिक-रासायनिक गुण (आवरण/गैर-आवरण, डीएनए/आरएनए, आकार सीमा)

भौतिक/रासायनिक उपचारों के प्रति वायरस का प्रतिरोध

वायरस का पता लगाने की क्षमता और जैव सुरक्षा

जीन थेरेपी उत्पादों के लिए, संकेतक वायरस चयन को अतिरिक्त रूप से विचार करना चाहिए: "प्रासंगिक वायरस" के रूप में वेक्टर वायरस की भूमिका; सहायक वायरस संदूषण का संभावित जोखिम; और प्रतिकृति के लिए सक्षम वायरस (आरसीवी/आरसीएल) का पता लगाने और सत्यापन की आवश्यकताएं।

अनुशंसित संकेतक वायरस पैनल

वायरस	प्रकार	लिफ़ाफ़ा	जीनोम	आकार (एनएम)	चयन का औचित्य/आवेदन
एमवीएम	पार्वोवायरस	कोई नहीं	एसएसडीएनए	18–26	गैर-आच्छादित मॉडल; सबसे छोटा आकार और उच्चतम प्रतिरोध; नैनोफिल्ट्रेशन सत्यापन के लिए उपयुक्त (आम तौर पर आरएएवी वेक्टर उत्पादों के लिए लागू नहीं)
पीपीवी	पार्वोवायरस	कोई नहीं	एसएसडीएनए	18–26	गैर-आच्छादित मॉडल; रक्त उत्पादों के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला सूचक वायरस
Reo-3	पुनः विषाणु	कोई नहीं	डीएसआरएनए	60–80	गैर-आच्छादित मॉडल; मध्यम आकार; उच्च शारीरिक स्थिरता
पीआरवी	हर्पीसविरिडे	हाँ	डीएसडीएनए	150–200	आच्छादित मॉडल; बड़ा आकार; व्यापक मेजबान रेंज
X-MuLV	रेट्रोवायरस	हाँ	एसएसआरएनए	80–110	आवृत रेट्रोवायरस मॉडल; CHO-व्युत्पन्न सेल सबस्ट्रेट्स के लिए उपयुक्त
बीवीडीवी	फ्लेविविरिडे	हाँ	एसएसआरएनए	40–60	आच्छादित मॉडल; रासायनिक निष्क्रियता विधियों (एचसीवी सरोगेट) का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है
वीएसवी	रबडोविरिडे	हाँ	एसएसआरएनए	70	आच्छादित मॉडल; व्यापक पीएच सहनशीलता; कम-पीएच निष्क्रियता सत्यापन के लिए उपयुक्त

तालिका 2. जीन थेरेपी उत्पादों के वायरल क्लीयरेंस सत्यापन के लिए अनुशंसित संकेतक वायरस पैनल

एएवी वेक्टर उत्पादों के लिए विशेष विचार

पुनः संयोजक एएवी वेक्टर उत्पादों के लिए, वीवो जीन थेरेपी उत्पादों पर आधारित आरएएवी वेक्टर के लिए फार्मास्युटिकल अनुसंधान और नैदानिक ​​​​परीक्षण अनुप्रयोगों के मूल्यांकन के लिए एनएमपीए तकनीकी दिशानिर्देशों को सक्षम एएवी (आरसीएएवी) की प्रतिकृति का पता लगाने पर ध्यान देने की आवश्यकता है। आरसीएएवी स्वायत्त प्रतिकृति में सक्षम एएवी को संदर्भित करता है, जो आम तौर पर सहायक प्लास्मिड और उत्पाद एएवी जीनोम के बीच समरूप पुनर्संयोजन से उत्पन्न होता है। आरसीएवी का पता आम तौर पर संक्रामक परख या क्यूपीसीआर तरीकों का उपयोग करके किया जाता है, जो दवा पदार्थ और शुद्ध उत्पाद पर अलग-अलग किया जाता है।

यह ध्यान देने योग्य है कि एएवी वेक्टर उत्पादों के लिए डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण प्रक्रियाओं में आम तौर पर न्यूक्लीज पाचन, क्रोमैटोग्राफी (एईएक्स), नैनोफिल्ट्रेशन और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (सीईएक्स/आईईएक्स) शामिल हैं। पारंपरिक वायरल क्लीयरेंस सत्यापन में, इन प्रक्रिया चरणों के परिणामस्वरूप एएवी वेक्टर को महत्वपूर्ण नुकसान हो सकता है; इसलिए, स्केल डाउन मॉडल डिज़ाइन के दौरान वेक्टर और संकेतक वायरस के बीच की बातचीत पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। कुछ प्रक्रिया चरणों (उदाहरण के लिए, नैनोफिल्ट्रेशन) के लिए जहां एएवी वेक्टर हानि पर्याप्त है, यह मूल्यांकन किया जाना चाहिए कि क्या सत्यापन डेटा के आधार पर प्रक्रिया समायोजन की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, नैनोफिल्ट्रेशन झिल्ली छिद्र आकार का समायोजन)।

सामान्य सिद्धांतों

The scale-down model (SDM) is the core tool for viral clearance validation; its design must accurately represent the viral clearance performance of the manufacturing process. ICH Q5A(R2), Section 6.2.2, explicitly requires that the scale-down model maintain consistency with the manufacturing process in key parameters. For gene therapy products, the following considerations are especially important in SDM design:

महत्वपूर्ण प्रक्रिया मापदंडों का प्रतिनिधित्व

स्केल डाउन मॉडल निम्नलिखित मापदंडों में विनिर्माण प्रक्रिया के अनुरूप होना चाहिए: क्रोमैटोग्राफिक स्थितियां (बफर संरचना, पीएच, चालकता); लोडिंग अनुपात (वेक्टर/सतह पर तैरनेवाला प्रोटीन द्रव्यमान अनुपात); संपर्क समय और तापमान; प्रवाह दर/निवास समय; उत्पाद की शुद्धता और संरचना। एएवी उत्पादों के लिए, नैनोफिल्ट्रेशन प्रदर्शन पर वेक्टर कण आकार वितरण और खाली कैप्सिड सामग्री के प्रभाव को भी विशेष रूप से संबोधित किया जाना चाहिए।

मॉडल योग्यता आवश्यकताएँ

ICH Q5A(R2) के लिए स्केल डाउन मॉडल की पर्याप्त योग्यता की आवश्यकता होती है, जिसमें शामिल हैं: उत्पाद की गुणवत्ता विशेषताओं की तुलना (उदाहरण के लिए, शुद्धता, पुनर्प्राप्ति, घनत्व); महत्वपूर्ण प्रक्रिया पैरामीटर संगति की योग्यता; और स्केल डाउन मॉडल को सुनिश्चित करना विनिर्माण प्रक्रिया की प्रक्रिया परिवर्तनशीलता को दर्शाता है। क्रोमैटोग्राफी चरणों के लिए, पीक प्रोफाइल, रेफरेंस और वॉश की स्थिरता योग्य होनी चाहिए; नैनोफिल्ट्रेशन चरणों के लिए, मात्रा क्षमता और उत्पाद संरचना के प्रभावों को सत्यापित किया जाना चाहिए।

एलआरवी गणना सूत्र

वायरल क्लीयरेंस प्रभावकारिता को मापने के लिए लॉग रिडक्शन वैल्यू (एलआरवी) मुख्य मीट्रिक है। ICH Q5A(R2), धारा 6.5, LRV गणना विधियों और सांख्यिकीय उपचार का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। मूल एलआरवी गणना सूत्र है: एलआरवी=लॉग₁₀(एन₀/एन), जहां एन₀ वायरस स्पाइकिंग के बाद प्रारंभिक वायरस टिटर है और एन प्रक्रिया उपचार के बाद अवशिष्ट वायरस टिटर है। जब अवशिष्ट वायरस टिटर परख की पहचान सीमा से नीचे आता है, तो पॉइसन वितरण जैसी अनुमान विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, बड़ी मात्रा में परीक्षण)।

कॉन्फिडेंस अंतराल का अनुप्रयोग

ICH Q5A(R2) और EMA CPMP/BWP/268/95 दोनों को LRV गणना परिणामों के आत्मविश्वास अंतराल मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। 95% विश्वास अंतराल आमतौर पर लागू किया जाता है।

प्रभावशीलता के लिए मानदंड

रक्त उत्पादों से वायरस को हटाने/निष्क्रिय करने के लिए एनएमपीए तकनीकी दिशानिर्देशों के अनुसार, 4 लॉग से अधिक या उसके बराबर की वायरस कमी इंगित करती है कि प्रक्रिया चरण वायरस हटाने/निष्क्रिय करने के लिए प्रभावी है। हालाँकि, यह मानदंड एक पूर्ण सीमा नहीं है और इसका मूल्यांकन निष्क्रियता कैनेटीक्स वक्र, संकेतक वायरस चयन के लिए वैज्ञानिक तर्क और सत्यापन प्रोटोकॉल डिजाइन की समग्र सुदृढ़ता के साथ समग्र तरीके से किया जाना चाहिए। जीन थेरेपी उत्पादों के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि समग्र वायरल सुरक्षा प्रोफ़ाइल स्वीकार्य स्तर पर है, सभी प्रक्रिया चरणों में संचयी निकासी क्षमता पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए।

नैनोफिल्ट्रेशन का अनुप्रयोग और चुनौतियाँ

वायरस {{0}प्रतिधारण निस्पंदन (नैनोफिल्ट्रेशन) जीन थेरेपी उत्पादों के डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण में एक महत्वपूर्ण वायरल क्लीयरेंस चरण है। विशिष्ट वायरस अवधारण फिल्टर का छिद्र आकार लगभग 20 एनएम होता है। नैनोफिल्ट्रेशन का वायरल क्लीयरेंस तंत्र मुख्य रूप से आकार आधारित बहिष्करण है, और यह झिल्ली छिद्र आकार से बड़े अधिकांश वायरस को प्रभावी ढंग से हटा सकता है, जिसमें एमवीएम और पीपीवी जैसे गैर-आवरण वाले छोटे पार्वोवायरस भी शामिल हैं।

हालाँकि, जीन थेरेपी उत्पादों के लिए नैनोफिल्ट्रेशन को अद्वितीय चुनौतियों का सामना करना पड़ता है: एएवी वैक्टर (लगभग 20-26 एनएम) का आकार कुछ संकेतक वायरस (उदाहरण के लिए, एमवीएम, 18-26 एनएम) के समान है, जिसके परिणामस्वरूप वेक्टर रिकवरी कम हो सकती है; खाली कैप्सिड निस्पंदन प्रवाह और वायरल प्रतिधारण दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं; वेक्टर सांद्रता के साथ नमूना चिपचिपापन काफी बढ़ सकता है। इसलिए, नैनोफिल्ट्रेशन सत्यापन के लिए एसडीएम डिज़ाइन को निस्पंदन प्रदर्शन पर वेक्टर कण आकार वितरण और खाली कैप्सिड सामग्री के प्रभावों को पूरी तरह से ध्यान में रखना चाहिए, और उचित रूप से बड़े छिद्र आकार के साथ नैनोफिल्टरेशन झिल्ली का उपयोग करने पर विचार किया जाना चाहिए।

क्रोमैटोग्राफी चरणों का वायरल क्लीयरेंस मूल्यांकन

आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (आईईएक्स) एएवी उत्पाद शुद्धि प्रक्रियाओं में एक मुख्य कदम है, आम तौर पर खाली और दोषपूर्ण कैप्सिड को पकड़ने के लिए आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (एईएक्स) या पूर्ण कैप्सिड के ठीक शुद्धिकरण के लिए कटियन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (सीईएक्स) के बाद न्यूक्लीज पाचन को नियोजित किया जाता है। क्रोमैटोग्राफी चरणों में वायरल क्लीयरेंस तंत्र में आकार बहिष्करण, इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन, एफ़िनिटी इंटरैक्शन और अन्य कारक शामिल हैं। एफडीए 2023 वायरल क्लीयरेंस संगोष्ठी में चर्चा में इस बात पर प्रकाश डाला गया कि क्रोमैटोग्राफी चरणों की वायरल क्लीयरेंस प्रभावकारिता लोडिंग क्षमता, पीएच, चालकता और राल साइक्लिंग सहित कई कारकों से प्रभावित होती है; व्यापक मूल्यांकन के लिए एक बहु-कारक ऑर्थोगोनल डिज़ाइन दृष्टिकोण अपनाया जाना चाहिए।

सतत विनिर्माण में वायरल सुरक्षा नियंत्रण

ICH Q5A(R2) का नया जोड़ा गया अध्याय 7 निरंतर विनिर्माण में वायरल सुरक्षा मूल्यांकन के लिए विशिष्ट आवश्यकताओं को निर्धारित करता है। जीन थेरेपी उत्पादों के लिए, निरंतर विनिर्माण एक महत्वपूर्ण विकास दिशा बन गया है, लेकिन यह नई वायरल सुरक्षा चुनौतियां भी पेश करता है। निरंतर विनिर्माण में वायरल सुरक्षा नियंत्रण रणनीतियों में शामिल हैं: महत्वपूर्ण रोकथाम उपायों के रूप में इन-इन-लाइन वायरस बैरियर फिल्टर; निवास समय और प्रक्रिया प्रवाह का उचित डिज़ाइन; परिभाषित होल्ड समय के साथ निष्क्रियता चरणों का समावेश; और महत्वपूर्ण प्रक्रिया मापदंडों की वास्तविक समय पर निगरानी के लिए प्रक्रिया विश्लेषणात्मक प्रौद्योगिकी (पीएटी) का उन्नत अनुप्रयोग।